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瑞圆舒®—全球首创猪圆环病毒2型、肺炎支原体二联疫苗

2021-11-22 13:41:39 来源:南方农村报

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瑞圆舒®—全球首创、“另起炉灶”的PCV2-M.hyo二联苗

瑞圆舒®不是两种现有疫苗简单混合而成的,而是从头开始研发的PCV2-M.hyo二联苗。为了使这个疫苗的两种抗原更好的“兼容”,发挥协同作用,在设计之初就对抗原、工艺、佐剂的选择和优化进行了创新。

第一,优化了猪肺炎支原体抗原的选择和生产工艺。考虑到联苗的特点和对PCV1-2抗原的兼容性,我们对猪肺炎支原体有效抗原的纯度和质量有更高的要求。硕腾科学家通过优化猪肺炎支原体的培养条件,将90%的猪肺炎支原体有效抗原保留在培养液中,在生产上摒弃了使用全细胞培养物作抗原的思路,而采用通过系列过滤来去除培养体系中的菌体(如图1-1),得到P97、P65、P45等更纯、浓度更高的有效抗原,使疫苗的安全性更好,免疫应答更高效和精准。

图1-1  通过过滤获得更高质量的猪肺炎支原体抗原

第二,进一步纯化猪肺炎支原体抗原,清除猪肺炎支原体培养液中的“杂质”。众所周知,猪血清常用于猪肺炎支原体疫苗的生产。在对细胞和活疫苗进行支原体检验中,《兽药典》也明确推荐了猪血清作为支原体检验用液体培养基的组成成分。培养M.hyo时需要猪血清,而猪血清中有许多抗体,其中就包括PCV2抗体。如图3-1所示,90%的猪肺炎支原体有效抗原和99%的抗PCV2抗体在猪肺炎支原体培养液过滤后的过滤液中。

硕腾运用“A蛋白”层析法将此过滤液进一步纯化(“A蛋白”是金黄色葡萄球菌的细胞壁成份,具有类似分子“海绵”的功能,选择性结合抗体。图1-2为“A蛋白”结合抗体示意图),此过滤液经过“A蛋白”层析柱以后,各种抗体(包括PCV2抗体)被清除,猪肺炎支原体培养过滤液被进一步纯化(图1-3)。这样就避免了和PCV2抗原做成联苗时,猪肺炎支原体抗原中的PCV2抗体结合疫苗中的PCV2抗原而影响其效价,也因此通过去除疫苗里的一些非必需蛋白来进一步增强安全性和免疫应答的有效性。

图1-2  “A蛋白”层析技术去除猪源抗体(包括PCV2抗体)



图1-3  猪肺炎支原体培养液经过滤和“A蛋白”层析技术处理前后示意图

第三,仍然采用PCV1-2嵌合体形式的高质量PCV2抗原。如图1-4所示,PCV1-2嵌合体种毒经培养、收获、灭活后得到的PCV1-2病毒粒子和PCV2具有完全一样的外壳,具有优秀的抗原构象,也无不同的抗原表达系统带来的外源抗原风险。

图1-4  PCV1-2病毒具有PCV2一样的抗原
 
第四,选择对两种抗原都有良好免疫增强作用的佐剂—MetaStim®。硕腾科学家通过和爱菲金®佐剂(用于M.hyo单苗)、SLCD®佐剂(用于PCV2单苗)以及它们的组合相比较,最后选中了MetaStim®佐剂。该佐剂也称为 SP油,是一种水包油(O/W)佐剂,由角鲨烷、 普兰尼克L121和聚山梨酯80组成,已被用于猪、牛、马疫苗几十年。它具有众多优点:诱导细胞免疫和体液免疫;对灭活抗原和活疫苗均有免疫增强作用;无毒无害无残留;粘度低,通针性好;无过敏反应,具有很好的安全性。其在联苗中的作用如图1-5所示,有助于两种抗原发挥更好的效果。
 
图1-5  选择对两种抗原都有良好免疫增强作用的MetaStim®佐剂

综上所述,如表1-1所示,瑞圆舒®是个“另起炉灶”的疫苗,充分考虑到PCV2和M.hyo两部分抗原来源有可能带来的不兼容,通过M.hyo抗原来源的选择、“A蛋白”层析技术的纯化,使得两种抗原来源的兼容成为可能,最后通过反复对比选择了对两种抗原都有良好免疫增强作用的佐剂,使得该疫苗成为真正的PCV2-M.hyo二联苗。
 
表1-1  瑞圆舒®所运用的主要技术和优势


瑞圆舒®的安全性和效力研究
 
1、安全性

瑞圆舒®的安全性在全球范围内被普遍证实。德国曾做过大规模的田间安全试验,历时6个多月,对17~19日龄的75424头仔猪接种了瑞圆舒®后进行了安全性评估。结果表明,未出现全身性不良反应猪只;4.13%的猪只在接种疫苗后的第1天出现局部反应;3.58%的猪只在注射部位出现红斑;2.13%的猪只注射部位出现肿胀;0.28%的猪只有疼痛反应。在第2天,注射部位肿胀的猪只比例降至0.19%,且没有猪只出现疼痛反应。关于注射部位肿胀的严重程度,如图2-1所示,在第1天有1.85%的猪只注射部位肿胀直径≤0.5cm,而注射部位肿胀直径≥5cm的猪只为0.28%。在第2天注射部位肿胀直径≤0.5cm的猪只比例下降到0.14%,注射部位肿胀直径>0.5cm且<5cm的猪只比例下降到0.05%。因此,在这次实验中,只有极少的猪只出现了局部反应,这些反应在48小时内消退。实验猪只无过敏反应,无嗜睡或食欲不振现象。其他国家的田间应用也同样证实了瑞圆舒®的安全性:免疫后体温稳定,无全身性过敏反应,注射部位很少或无局部反应。

图2-1  瑞圆舒®接种后注射部位局部反应评估(德国)
 
注:1分:很小肿大,直径≤0.5 厘米;2分:中等肿大,直径0.5- 5厘米之间;3分:严重肿大,直径≥5厘米;4分:严重肿大,整个脖子侧面都肿大。

2、效力研究
 
(1)PCV2的免疫保护效力研究

众多研究评估瑞圆舒®对PCV2的免疫保护效力,在其中一项中(硕腾研究报告号:B822R-US-12-046),48头19~23日龄(平均21日龄)的健康仔猪被分为两组,每组各24头。试验设计如表2-1,D0(21日龄)接种疫苗,D21(42日龄)攻毒,D42(63日龄)试验结束,安乐死所有试验猪。在攻毒后不同时间点收集样品,通过ELISA、qPCR和免疫组化等方法评价瑞圆舒®的免疫保护效果。
 
表2-1  瑞圆舒®攻毒保护试验设计

注:FAID50是用免疫荧光方法测定病毒半数组织感染量。
  

PCV2病毒血症结果显示,如图2-2所示,攻毒后,瑞圆舒®免疫组和对照组中出现病毒血症的猪只比例分别为8%和96%,瑞圆舒®免疫组比对照组出现病毒血症的猪只数量减少91%,两组差异极其显著(P≤0.0001);瑞圆舒®免疫组中出现病毒血症猪只的血液中,病毒拷贝数显著低于对照组,降低倍数可达10万倍(图2-3)。

图2-2  瑞圆舒®组和对照组攻毒后病毒血症猪数量
 
图2-3  瑞圆舒®组和对照组攻毒后病毒血症猪的病毒拷贝数差

粪便排毒结果显示,如图2-4,攻毒后,对照组和瑞圆舒®免疫组分别有83.3%和25%的猪只出现排毒,瑞圆舒®免疫组比对照组排毒猪只数量减少了70%,差异极其显著(P=0.0002)。
 
 
图2-4  瑞圆舒®组和对照组攻毒后粪便排毒猪比例
 
图2-5  瑞圆舒®组和对照组攻毒后有淋巴病变和免疫组化阳性猪的比例
  
抗体结果显示,对照组猪只在攻毒前保持抗体阴性,瑞圆舒®组猪只攻毒后各采样时间点抗体水平均显著高于对照组(P≤0.0056),并观察到明显的抗原特异性免疫记忆。 
  
免疫组化结果显示,如图2-5,与对照组相比,瑞圆舒®免疫组能显著改善所有指标(P<0.05),淋巴耗竭、组织细胞取代、免疫组化阳性的猪只比例分别下降91%、100%和77%。
  
综上所述,瑞圆舒®免疫后有助于预防PCV2病毒血症、降低粪便排毒、减少淋巴耗竭及其在淋巴组织的定殖,促进猪只接触PCV2后产生特异性免疫记忆,从而有助于预防PCVAD和亚临床感染的发生。

(2)M.hyo的免疫保护效力研究
 
在一项瑞圆舒®对猪肺炎支原体感染的保护效力研究(硕腾研究报告号: B823R-US-13-136)中,60头17~20日龄健康仔猪被分为两组,瑞圆舒®免疫组和对照组各30头。适应3天以后,免疫组于D0(大多为21日龄)接种瑞圆舒®疫苗,对照组注射等量的无M.hyo抗原的PCV2疫苗。在接种后第21天和第22天(即D21、D22),连续两天对所有试验猪进行气管内接种猪肺炎支原体强毒(10mL肺部匀浆/头/次,5.5×105 CCU/mL)。

攻毒28天后(即D49),所有试验猪被安乐死,按肺部病变百分进行肺部评分,将其平方根反正弦变换后,用混合线性模型进行分析。分析结果如图2-6所示,瑞圆舒®免疫组的肺部病变差异极显著(P≤0.0001)低于对照组,降低了76.3%。

图2-6  攻毒后瑞圆舒®免疫组和对照组的肺部病变比较

另外,试验还对免疫及攻毒前后血清中的猪肺炎支原体特异性抗体进行了比较,发现瑞圆舒®免疫组攻毒后有明显的抗原特异性免疫记忆。

本研究表明,瑞圆舒®接种后能显著减少猪肺炎支原体引起的肺部病变,能对肺炎支原体攻毒产生明显的特异性免疫记忆。

(3)免疫保护期研究
 
对PCV2免疫保护期的研究

在一项瑞圆舒®对PCV2免疫保护期的研究(硕腾研究报告号: B824R-US-13-118)中,60头3周龄(21&plu**n;3日龄)的健康易感仔猪被分为两组,瑞圆舒®免疫组和对照组各30头。试验设计如表2-2所示,D0(平均21日龄)时免疫组接种瑞圆舒®疫苗,对照组接种等量的PBS,23周以后(D161)对所有试验猪鼻腔接种PCV2活毒,D190天试验结束。在攻毒后不同时间点收集样品,通过ELISA、qPCR和免疫组化等方法评价瑞圆舒®的免疫保护期。
 
表2-2  瑞圆舒®攻毒保护试验设计


 
PCV2病毒血症结果显示,攻毒后,对照组57.1%的猪只出现病毒血症,瑞圆舒®免疫组没有猪只出现病毒血症。两组攻毒前后每毫升血清中PCV2 DNA拷贝数对数的最小二乘几何均数见图2-7,差异极显著(P≤0.0009)。

图2-7  攻毒前后不同时间血清中病毒血症的变化
注:为方便作图,0转换为1,实际上是0

粪便排毒结果显示,攻毒后,对照组在D174~D190有60.7%的猪只发生排毒,免疫组只在D174检测到20.7%的猪只发生排毒。D174粪便排毒量,对照组和免疫组的PCV2 DNA拷贝数对数的最小二乘几何均数分别为203.4550和6.0078,免疫组显著低于对照组(P≤0.011)。

抗体结果显示,D42至攻毒前,免疫组PCV2抗体水平显著高于对照组(P≤0.0048);攻毒后至试验结束,免疫组抗体水平极其显著高于对照组(P≤0.0005)。

免疫组化结果显示,在所有的淋巴结和扁桃体样本中,免疫组和对照组中的病毒检出率分别为3.6%和34.6%,免疫组显著低于对照组,降低了89.7%。

对猪肺炎支原体免疫保护期的研究

在一项瑞圆舒®对猪肺炎支原体免疫保护期的研究(硕腾研究报告号: 824-US-15-505)中,66头健康仔猪被随机分成两组,D0(20~22日龄)时免疫组接种瑞圆舒®疫苗,对照组接种无PCV2抗原的猪肺炎支原体疫苗。D160和D161连续两天给每头试验猪气管内接种猪支原体肺炎组织匀浆20mL。攻毒28天后(D189),所有试验猪被执行安乐死,按病变百分进行肺部评分,将其平方根反正弦变换后,用混合线性模型进行分析。另外,试验结束时肺部取样用于综合分析。

肺部病变评分结果:对照组和瑞圆舒®免疫组的肺部病变最小二乘均数分别为3.3和1.9(如表2-3所示),瑞圆舒®免疫组显著低于对照组(P=0.036)。
 
表2-3  肺部病变评分比较
  最小二乘均数分析 四分位分析
  数量 平均数 标准差 范围 最小值 下四分位 中位数 上四分位 最大值
对照组 34 3.3* 0.62 0~18.2 0 1.4 2.7 5.8 18.2
瑞圆舒®组 32 1.9* 0.48 0~8.6 0 0.5 1.8 3.8 8.6
注:“*”为经逆转换的肺部病变最小二乘均数。

免疫组化结果显示,瑞圆舒®免疫组和对照组的猪只肺部的病原检出率分别为53.1%和80%。

由上述关于瑞圆舒®免疫保护期的研究可知,一方面,瑞圆舒®免疫23周后接受PCV2攻毒,仍能有助于预防病毒血症,有助于降低粪便排毒和病毒在淋巴结与扁桃体中的定殖,以及产生特异性免疫记忆。另一方面,瑞圆舒®免疫23周后接受M.hyo攻毒,仍能显著减少猪肺炎支原体引起的肺部病变,减少猪肺炎支原体在肺部的定殖。目前,美国和欧盟已经批准“瑞圆舒®免疫接种猪只后,诱导针对PCV2和猪肺炎支原体的保护力可持续23周”的说明书申请。
 
临床应用和效益
 
瑞圆舒®已在美国、欧盟及亚洲多个国家上市,众多田间报道体现其优秀的效果。匈牙利的六个猪场(600~2500头母猪/场)评估了瑞圆舒®的安全性和有效性,总共对8887头18~28日龄仔猪进行了瑞圆舒®疫苗的接种,其他仔猪继续按照原有免疫程序进行接种(PCV2单苗、M.hyo单苗或其他PCV2、M.hyo混苗),结果显示,瑞圆舒®接种后无全身性过敏反应,瑞圆舒®免疫猪在生产性能的多个指标上都有所改善(表3-1)。
 
表3-1  瑞圆舒®和其他疫苗接种后生产性能总体改善情况

 
2016年11月到2017年1月,法国最大的猪兽医机构从业人员,根据改良的Madec肺部评分系统,对21个猪场的6386头上市猪进行了肺部病变评分,其中3167头接种瑞圆舒®疫苗,3219头接种其他疫苗(PCV2单苗、M.hyo单苗或其他PCV2、M.hyo混苗)。结果显示,两组之间的平均肺部评分和无病变肺脏百分比均无统计学差异(表3-2),但从图3-1和图3-2可知,瑞圆舒®免疫组肺部评分和肺部无病变中位数都优于其他疫苗免疫组。因此,该田间试验证实瑞圆舒®在预防呼吸道病变方面优于其他疫苗,并在实际生产中减少了断奶时对猪的操作次数。
 
表3-2  不同疫苗处理的猪只肺部评分比较


 注:上标一致,表示无统计学差异。
    
图3-1  肺部评分比较
                    
图3-2  无肺部病变猪的比例比较
注:第二组为接种瑞圆舒®组

Jiwoon J等(2016年)在有PCVAD和猪支原体肺炎病史的3个韩国猪场进行了瑞圆舒®免疫效果研究,每个场选取3周龄仔猪80头,其中40头接种瑞圆舒®疫苗,另外40头作对照组(不免疫)。免疫后监测至上市,从临床表现、生产性能、体液免疫、细胞免疫等多个方面评估免疫效果。总体上,由表3-3知,瑞圆舒®免疫组较不免疫组上市体重和成活率改善显著,每头猪经济收益增加47.42美元。另外,瑞圆舒®免疫可有效提升PCV2中和抗体水平,诱导产生PCV2和M.hyo的特异性γ干扰素分泌细胞(IFN-γ-SC),减少PCV2的病毒血症、M.hyo的肺部菌体载量,减少肺部和淋巴组织病变。
 
表3-3  瑞圆舒®免疫组和不免疫组的经济利益比较

注:上标字母不同代表差异显著。

瑞圆舒®的有效性和安全性在全球范围内被多个国家的实验室和农场普遍证实,可以被用来预防PCVAD和猪支原体肺炎,已经被证实对PCV2和猪肺炎支原体具有23周的免疫保护力,并在生产性能方面带来经济效益。

结语

PCV2和猪肺炎支原体都是猪的重要原发性病原,在我国猪群普遍存在,并引起重大的经济损失。接种有效疫苗是控制这两个疾病的简单、有效的方法。瑞圆舒®是全球首创的单针PCV2和猪肺炎支原体二联疫苗,是“另起炉灶”的疫苗,并非由原来两个疫苗的简单混合,而是从产品设计开始就关注PCV1-2和猪肺炎支原体组份的兼容性,优化了猪肺炎支原体抗原来源,采用创新工艺去除了疫苗组份中PCV2等猪源抗体,选择了对PCV1-2和猪肺炎支原体两种抗原都有良好免疫增强作用且安全的佐剂。实验室和田间广泛证明瑞圆舒®安全、高效,一针免疫后,有助于预防PCV2的病毒血症、降低相关的淋巴耗竭和病原体的定殖,减少PCV2排毒,从而有效预防猪肺炎支原体引起的地方性肺炎,对PCV2和猪肺炎支原体均达23周的免疫保护期。在当前非洲猪瘟、猪价低迷、降本增效的大背景下,一方面,瑞圆舒®一针免疫,操作简单,无需混合,抽取后直接注射,杜绝了混苗时发生交叉污染的风险,也减少了频繁接触猪时传播疾病的风险;另一方面,一针免疫就能对PCV2和猪肺炎支原体提供优秀的保护,节约了人工,经济效益优势显著。
 
注意事项:

▪储存在2-7 °C(35-45 °F)
▪不能冷冻
▪第一次打开时全部用完
▪在屠宰前21天不接种疫苗
▪含有庆大霉素和硫柳汞作为防腐剂
▪过敏反应虽然罕见,但也可能发生
▪过敏反应注射肾上腺素

责任编辑:张帆
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